【导语】ctDNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 通常由肿瘤细胞主动分泌或在肿瘤细胞凋亡或坏死过程中释放入循环系统中的DNA片段。ctDNA会携带来源于肿瘤细胞相关的遗传学特征，如基因突变、甲基化、扩增或重排等，可作为肿瘤筛查、伴随诊断、治疗疗效评估及预后风险分层的重要指标。因其无创或微创、检测时间短、能够反映瘤内和转移灶异质性、可动态监测治疗疗效等优势而在结直肠癌（CRC）精准诊疗中得到越来越广泛的应用,而临床实践中ctDNA检测的主要技术问题及质控标准亟需关注。
为进一步规范ctDNA 检测的应用，欧洲肿瘤内科学会（ESMO）精准医学工作组日前邀请了多名行业知名专家对ctDNA 检测在肿瘤患者中的有效性和适用性进行了全面、系统性地阐述，详细说明了ctDNA检测前处理、出具报告及临床使用时应该考虑的问题，并做出了相关推荐建议。文章于2022年7月发表在ESMO官方期刊 《肿瘤学年鉴》（Annals of Oncology）[1]。
本文将重点聚焦于ctDNA检测技术、检测报告规范化以及ctDNA在CRC诊疗中的价值三个部分的亮点撷萃，供读者交流。
ctDNA检测技术方面的建议
ctDNA检测参与肿瘤诊疗的多个环节（图1），包括疾病筛查、术后微小残留病灶（MRD）评估、复发预测、晚期肿瘤的基因分型、治疗效果的评估、响应监控以及耐药机制识别等。ctDNA的检测方法有NGS测序、数字PCR、BEAMing和质谱技术等，不同平台检测灵敏度和应用场景亦不相同。需要关注的是，每种检测方法都有其局限性，因此对于不同的科研或临床问题，应选择适宜的检测方法，严格遵循检测过程中各质控环节标准，是ctDNA检测成功的关键。患者个体化因素对ctDNA 释放的影响、样本量、采集管选择、样本存储和处理方式等，都会不同程度地影响ctDNA检测结果。对此，应用方面ESMO精准医学工作组给出了以下7点建议。
图1、ctDNA检测的临床应用以及不同疾病阶段时ctDNA水平
ctDNA检测的采血时间应根据临床情况谨慎选择，因为不同的因素会影响ctDNA的释放。ESMO精准医学工作组建议：
1）如需术后检测ctDNA-MRD，理想情况下需要至少术后1周进行；对于创伤较大的手术，检测需要等到术后2周或更长的时间。
2）如果检测目的为晚期肿瘤基因分型，应避免对积极治疗有效或无进展的肿瘤患者采血，从而降低假阴性结果的发生率。
根据ctDNA 样本处理时间和所使用的检测方法进行选择（建议采用含细胞稳定剂的抗凝管，并尽快完成血浆分离）。
在进行ctDNA提取前，血浆样本应被储存在-80℃的环境中，同时要求温度变化尽可能小，并尽可能减少样本的连续冻融。
假阴性是ctDNA检测中一个不可忽视的问题，可能和血浆ctDNA水平低、检测灵敏度不足或“非脱落”肿瘤（non-shedding tumor，即肿瘤本身不释放ctDNA）三方面因素有关。
CHIP（克隆性造血）是ctDNA检测中假阳性的常见原因。因此，ESMO精准医学工作组建议对血浆ctDNA和白细胞DNA进行同步检测分析，进而识别CHIP突变、降低假阳性率。
ctDNA可检测到癌症易感基因的致病性胚系突变（例如，BRCA1、BRCA2、PALB2）。这种情况下，ESMO精准医学工作组建议使用经过验证的检测方法进行返回式胚系检测（reflex germline testing），以区分体系变异和胚系变异。
通过评估肿瘤纯度，临床基因分型检测可以提高真阴性检测结果的可靠性。
除了常规的临床分子实验室报告包含的内容，基于ctDNA检测方法以及检测目的，此次ESMO精准医学工作组给出了更为全面的报告建议（表1），进一步提高了ctDNA检测报告的规范性、准确性以及实用性。
表1、ctDNA检测报告应包含的内容以及报告建议
ctDNA检测在CRC领域的应用
来源或发病位置不同的肿瘤之间，在分子病理层面既有共性也有差异性。随着对分子靶标研究的深入，ctDNA 检测在不同的肿瘤中也探索出了不同的适用要点。在本次ESMO 精准医学工作组对ctDNA检测的建议中，我们也集中汇总了与CRC相关的内容。（其他瘤种相关的内容可在文末的原文链接中获取）
在晚期CRC基因分型方面，ESMO精准医学工作组给出了常用的分子靶标及相关ctDNA检测建议（表2 ）：
1）当组织检测不可行或需要紧急做出治疗决策时，推荐KRAS/NRAS/BRAF V600E/MSI的ctDNA检测用于未接受过化疗的转移性CRC；
2）EGFR再挑战之前，建议对已接受过抗EGFR单抗治疗的患者进行KRAS/ NRAS/ BRAF/ EGFR-ECD的ctDNA检测。值得一提的是，虽然KRAS突变可以发生在CHIP中，但发生率很低，因此结直肠癌患者的KRAS突变更有可能是真阳性而不是假阳性。
表2、在晚期CRC基因分型方面的ctDNA 检测建议
在晚期CRC动态监测方面，一项前瞻性研究显示，转移性CRC患者一线化疗2个周期后，ctDNA下降10倍与无进展生存期（PFS）相关。在另一项研究中，1个或2个化疗周期后ctDNA浓度变化可预测转移性CRC患者的治疗反应和PFS[2-3]。因此，晚期CRC患者的ctDNA动力学结果与患者预后密切相关。但目前没有足够的证据表明如何根据这些发现采取相应措施可以改善患者预后。未来仍需要随机介入研究来评估ctDNA动力学结果的临床效用。
在MRD/分子复发（MR）监测方面，已有大量研究证实在早期CRC患者治疗结束后或监测期间进行ctDNA的检测，可有效预测疾病复发。同时，当前也有多项在研的随机对照研究聚焦于ctDNA作为CRC MRD/MR标志物的临床实用性。但是适用于晚期肿瘤基因分型的ctDNA检测方法对于MRD/MR灵敏度不足，同时由CHIP突变产生的假阳性率也较高，因此需要开发具有针对性的检测方法，进一步发挥ctDNA检测在MRD/MR监测方面的优势和作用。
小结
近年来，随着靶向及免疫治疗药物临床研究的不断开展和成功，各类肿瘤的临床治疗手段得到了突飞猛进的发展，精准的检测和诊断进一步推动了临床肿瘤的精准治疗。ctDNA检测在肿瘤诊疗中的作用毋庸置疑，随着对检测技术、检测方法、报告解读等多个方面的不断规范和完善，ctDNA也将作为更便捷、更实用、更可靠的液体活检技术、助力临床。在CRC诊断、治疗、随访监测的多个环节，ctDNA检测的应用又有其特殊性，因此开展具有针对性的随机对照研究来探索ctDNA在CRC中的应用是十分必要的，未来也将为ctDNA更好地服务CRC患者提供更多的证据和信心。
参考文献：
1. Pascual J, Attard G, Bidard FC, Curigliano G, De Mattos-Arruda L, Diehn M, Italiano A, Lindberg J, Merker JD, Montagut C, Normanno N, Pantel K, Pentheroudakis G, Popat S, Reis-Filho JS, Tie J, Seoane J, Tarazona N, Yoshino T, Turner NC. ESMO recommendations on the use of circulating tumour DNA assays for patients with cancer: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Ann Oncol. 2022 Jun 9:S0923-7534(22)01721-5.
2. Tie J, Kinde I, Wang Y, et al. Circulating tumor DNA as an early marker of therapeutic response in patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol. 2015;26:1715-1722.
3. Garlan F, Laurent-Puig P, Sefrioui D, et al. Early evaluation of circulating tumor DNA as marker of therapeutic effificacy in metastatic colorectal cancer patients (PLACOL study). Clin Cancer Res. 2017;23:5416-5425.
点击获取原文：
https://www.annalsofoncology.org/article/S0923-7534(22)01721-5/fulltext
